신경과 영역에서 NGS의 활용 및 최근의 치매 치료 전략

한국의약통신l승인2017.01.12 14:11:53

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NGS는 기존의 유전자 염기 서열 방식을 개선하여 신뢰도와 정확성을 높였고, 최근에는 전체 유전자를 분석하지 않고 유전자의 일부인 exome만을 선택적으로 분석하거나 이미 작성된 gene panel을 활용하는 등 다양한 방법으로 진화하고 있다.

오늘 좌담회에서는 NGS 기술의 발전이 치매나 파킨슨병 등 신경계 질병의 진단과 치료에 어떻게 활용되는지 살펴보았다. 아울러, 최근의 치매 치료 동향에 대해 ASCOMALVA 연구를 중심으로 정리해 보았다. (편집자 주)

좌장 : 조광덕(강릉아산병원)
연자 : 이진호(삼척의료원), 장우영(강릉아산병원)
패널 : 정태익(강릉동인병원), 이문규(강릉아산병원), 박인석(동해동인병원), 손태옥(강릉의료원)

신경과 영역에서 차 세대 염기 서열 분석(Next Generation Sequencing)의 발전과 전망 (이진호, 삼척의료원)

▲ 이진호 과장(삼척의료원)

인간은 누구나 DNA를 갖고 있고 DNA 내에는 유전자가 들어 있다. 유전자에 있는 intron과 exon은 아미노산과 단백질을 합성하며 개인 간의 차이를 만들어 내는 SNP이 존재한다. DNA의 전사(transcription)와 번역(translation)을 거쳐 아미노산이 합성된다. 이 과정에서 생성되는 mRNA는 세포 밖으로 나와서 발현하게 되는데, 그 발현양은 qRT-PCR로 알 수 있다. 세포 내에는 endogenous microRNA가 존재하여 mRNA의 발현을 조절한다. 또한 연구에 주로 활용되는 siRNA(small interfering RNA)는 유전자 내에서 원하는 특정 부위를 절단할 수 있고 연구에 필요한 특정 부위를 knock-down시킨 마우스 등 실험 동물 조작에도 많이 활용된다.

차세대 염기 서열 분석은 무엇인가?
고식적인 염기 서열 분석 방법은 매우 단순하였다. 유전자를 분리하고 토막 낸 후 형광 물질을 입힌 염기를 붙인다. 이 때 유전자 길이에 따라 염기가 붙는 위치가 다르므로 이를 디텍터로 감지하여 유전자 염기 서열을 알 수 있었다. 반면, 차세대 염기 서열 분석(NGS; next generation sequencing)은 DNA를 추출하고 DNA library를 제작(DNA에 primer 부착)한 후 이를 ‘증폭(amplification)’시킨다.

고식적인 염기 서열 분석 과정에는 이 증폭 과정이 없다. 증폭시킨 DNA library를 이용하여 염기 서열을 파악하고, 이후 ‘데이터 분석(bioinformatics)’을 통해 본래의 DNA 염기 서열을 파악하게 된다. DNA 샘플 준비 과정에서의 증폭과 데이터 분석 과정이 고식적인 방법과 차이점이라 할 수 있다. NGS를 이용하면 전체 유전자 염기 서열(whole genome sequencing)과 전사된 RNA의 염기 서열을 파악할 수 있으며, 단백질 합성에 관여하는 exome과 siRNA 등 전체 유전자 중 원하는 부위를 표시하고 해당 부위의 염기 서열을 선택적으로 파악할 수 있다. 최근 NGS의 뜨거운 이슈는 증폭하는 기기와 bioinfomatics에 어떤 방법을 적용시키는 가 이다. 이에 따라 분석에 소요되는 시간과 비용이 천차만별도 달라지게 된다.

신경과 영역에서 NGS의 활용
신경계 질환은 약 1/3이 유전적 원인에 의해 발병한다고 알려져 있다. 대표적인 유전적 신경 질환으로는 CMT(Charcot-Marie-Tooth disease)가 있다. 이 질환은 유전자 변이 때문에 말초 신경의 탈수초화(demyelinating)되고 축삭(axon)이 손상되는데, 그 원인은 70여 가지나 알려져 있다. 2011년 수 많은 사례 분석을 통해 CMT의 진단 pathway가 Ann Neurol에 발표되었다.

이 pathway에는 MNCV(motor neuron conduction velocity) slow, very slow, intermediate 및 axonal CMT에 따른 진단 기준이 제시되어 있다. 불과 3년 후인 2014년 NGS를 이용한 CMT 진단 방법이 Clin Genet에 발표된다. 이는 MNCV에 따라 특정 유전자만 선택적으로 분석하고, 음성일 경우 CMT panel 또는 전체 exome 염기 서열을 분석하도록 하였다. 이를 통해 의심되는 유전자 변이를 선별할 수 있고 그 유전자 변이가 환자의 신경계 질환을 유발하는지, 그 상관 관계를 파악하게 된다. 사과 1개가 전체 유전자라면 이 중 exome은 1%의 사과 한 조각에 해당한다. 따라서 분석 비용, 소요 시간, 오류 가능성은 전체 exome 염기 서열 분석(whole exome sequencing) 시 훨씬 줄어든다.

유전자 패널(Gene Panel)
CMT의 원인 유전자는 약 70여 개가 알려져 있다. CMT와 관련된 biopathy, 미토콘드리아 관련 질환 등의 유전자 목록을 업체에 주고, 환자 사례 수 백 건이 모아지면 유전자 패널을 만들 수 있다. 그러면 이를 토대로 필요한 환자의 샘플을 보내면 관련 유전자의 변이가 있는지 없는지 분석이 가능하다.

전체 유전자 대비 전체 exome의 비율은 1/00이고, CMT와 관련된 100가지 유전자 검사를 하는 것은 전체 exome의 0.01%에 해당하므로 시간과 비용을 현저하게 아낄 수 있고 분석의 오류도 줄일 수 있다. 실제로 분석을 해보면 이미 CMT와 관련된 유전자가 확인된 환자 114명은 동일한 결과를 나타내었고, 원인을 찾지 못한 환자 137명의 1/3은 CMT와 관련이 있을 것으로 생각되는 유전자를 찾을 수 있었다. [그림 1]

▲ [그림 1] CMT 환자에서 유전자 패널을 이용한 변이 유전자의 확인

결론
NGS는 점차 효율은 증가하고 비용은 감소하는 방향으로 발전하고 있다. 전체 exome 염기 서열 분석은 유전자 변이 확인율이 높고 새로운 유전자 변이나 de novo 변이를 확인하는데 매우 유용하다. 또한 유전자 패널은 exome 염기 서열 분석보다 훨씬 더 효율적인 방법이며, 질병과 관련된 새로운 유전자를 찾기는 어렵지만 분석 비용이 환자 1인 당 20~30만원 정도로 저렴하므로 활용도가 높은 편이다.

< Q & A >
정태익: NGS로 target gene sequencing을 하면 비용을 절감할 수 있다. 저는 YOPD(young onset Parkinson’s Disease) 환자 진료에 gene panel을 이용하고 있다. 500 kilobase 정도의 유전자를 선별하여 exome만 분석하면 용량이 8~10GB 정도이다. 참고로, gene panel 분석 비용은 얼마나 많은 유전자가 포함되어 있느냐에 따라 크게 달라진다. 한국인 CMT 환자의 gene panel에 대한 논문이 발표되었는가? 이진호 교수가 연구자로 참여했던 연구인가?

이진호: 저는 8월에 논문을 완성하고 추계학술대회에서 우수 논문으로 추천되었다. 아직 저널에 공식적으로 게재되지는 않았다. 환자 사례를 좀 더 확보하고 전체 유전자 염기 서열 분석까지 해서 논문을 좀 더 보완하려고 준비 중이다.

장우영: CMT와 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머 치매 등의 원인은 모두 다르다. 이 환자들이 어떤 유전적 소인을 가지고 있으며 그에 따른 맞춤형 치료를 제공하는 방향으로 의학이 발전할 것이라 생각한다. 그러나 실제로 파킨슨병이나 알츠하이머 치매 환자의 NGS를 해 보면 의외로 유전적 소인을 확인하기가 어려운 편이다. NGS 결과는 쉽게 해석할 수 없으므로 유전학 교실과 협력을 필요로 할 때가 많다. 대조군이 없는 상황에서 gene panel을 할 경우, 이미 알려져 있는 유전자 변이가 있다면 변이율이 어느 정도인지 파악할 수 있지만 새로운 변이(novel mutation)은 어떻게 찾을 수 있는가?

이진호: 1차적으로 연구실 내에서 확인하고 실패할 경우 gene panel을 시도하며 이후에는 전체 exome 염기 서열 분석을 한다. 이 때에도 확인되지 않으면 전체 유전자 염기 서열을 분석한다.

장우영: 강의에서는 gene panel을 만들고 NGS를 돌리면 known mutation과 novel mutation을 찾을 수 있다고 들었다.

이진호: Gene panel은 target gene sequencing이다. 따라서 novel mutation을 찾을 수는 없다. 제 발표 자료에서 novel mutation을 찾았다는 것은 전체 exome 염기 서열 분석을 통해서 찾은 것이다. 즉, 기존에 CMT 원인 유전자라고 밝혀지지 않은 유전자 중 전체 exome 염기 서열 분석 결과 CMT 원인 유전자로 새롭게 규명된 사례를 말씀 드린 것이었다.

장우영: 전체 exome 염기 서열 분석 결과를 엑셀 파일로 받아 보면 extension mutation도 수 백 개에 이르는 등 분석 결과를 이해하기도 어렵고, 그 중에서 novel mutation은 어떻게 찾아야 할지 잘 모르겠다.

이진호: 그 자료로부터 novel mutation이라고 확인하는 그 과정을 밝힌다면 Brain에 게재될 만 한 논문이다. 이미 그에 대한 논문 2건이 Brain에 발표된 바 있다. CMT는 우성 유전되는 질환이다. 환자의 부모는 물론 그 위 조부모까지 3대에 걸친 유전자 분석을 한다.

정우영: 그 과정에서 target gene을 얻고, 이를 집중 분석하여 novel mutation을 찾는 것인가?

이진호: 그렇다. 그 과정에서 3개 가량의 유전자를 얻게 된다. 유전자가 어느 조직에서 발현이 되는지는 이미 데이터베이스화 되어 있다. 따라서 해당 유전자를 in vitro 또는 in vivo 모델을 만들어서 질병과의 연관성을 확인할 수 있다. 예를 들어, 근육병증(myopathy)을 유발하는 새로운 유전자 3개를 발견했다고 하자. 이 중 2개는 근육 조직에서 발현되지 않는다면 이는 근육병증과 상관이 없는 것이다. 따라서 근육에서 발현되는 나머지 1개의 유전자가 질병을 일으키는 것으로 결론지을 수 있다.

장우영: 파킨슨병이나 간질 등 수 많은 신경과 질병에 대한 gene panel이 필요하고, 반드시 한국인 유전자 정보여야 한다. 이러한 gene panel이 완성되면 환자의 유전적 정보를 확인하고, 이를 근거로 치료 전략을 수립해야 할 것이다.

최근의 치매 치료 동향(Recent Update of Dementia Treatment) (강릉아산병원, 장우영 교수)

▲ 장우영 교수(강릉아산병원)

알츠하이머 치매(Alzheimer’s Disease; AD) 치료 약물의 작용 기전
AD의 발병과 가장 밀접한 관련이 있는 신경전달 체계는 cholinergic system의 저하와 glutamatergic system의 항진이다. 특히, AD 환자는 Meynert 기저 신경핵(basal nucleus of Meynert) 부위의 acetylcholine 농도가 저하되어 있다는 보고가 많은데, 파킨슨병 환자도 cholinergic system이 저하되어 있는 편이다.

즉, choline acetyltransferase가 저하되어 acetylcholine의 생성이 감소하고, 신경 세포의 choline uptake가 감소하여 인지 기능이 저하된다. 실제로 항콜린성 약물(anti-cholinergics)을 투여하면 인지 기능이 저하됨이 잘 알려져 있다. 따라서 cholinesterase inhibitor(ChEIs)를 AD 치료제로 투여할 수 있다. ChEIs가 AD 환자의 인지 기능에 미치는 영향을 보면, 투여 초기에는 기능이 크게 향상되었다가 꾸준히 투여하면 다시 감소하는 경향을 보인다. 그러나 분명한 점은 약물을 투여하지 않은 환자보다 ChEIs를 투여한 환자의 인지 기능이 훨씬 낫다는 점이다.

ChEIs의 유효성
ChEIs와 memantine 병용 요법은 단순히 증상만 호전시키는 것인지 아니면 질병 조절 효과(disease modifying effect)가 있는 것인지 생각해보자. 2002년 발표된 연구에서는 ChEIs 투여 유무에 따라 AD 환자가 요양원에 입원하는 시점을 비교하였다. 이 연구에 따르면, ChEIs를 복용한 환자가 요양원에 입원하는 시기가 복용하지 않은 환자보다 훨씬 늦었으므로, 환자의 기능이 비교적 잘 유지됨을 알 수 있었다(J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2002). 또한 donepezil을 투여하면 투여하지 않은 환자보다 해마 부피(hippocampal volume) 감소가 유의하게 적었다(Am J Psychiatry, 2003).

CSF phosphorylated tau 농도는 AD 진단을 위한 중요한 biomarker이다. Memantine은 CSF p-tau 농도를 현저하게 감소시키는 효과가 보고되어 있다(Dement Geriatr Cogn Disord, 2007). 이러한 연구를 바탕으로 memantine과 ChEIs 병용 요법이 AD 환자의 요양원 입원 시기를 얼마나 지연시키는지 평가하는 연구가 진행되었다. 연구 결과, memantine/ChEIs 병용 요법은 ChEIs 단독 요법보다 요양원 입원률을 유의하게 감소시켰다. 따라서 AD를 치료하지 않는 것보다 치료를 하는 것이 훨씬 좋고, 처음부터 ChEIs와 memantine을 투여하면 더욱 유리하다고 할 수 있겠다(J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2009). [그림 2]

▲ [그림 2] ChEIs/memantine 병용 요법의 요양원 입원률 감소 효과

ASCOMALVA 연구에 대한 고찰
AD의 발병과 진행에 acetylcholine의 부족이 중요한 원인이라면 ChEIs뿐만 아니라 cholinergic precursor 를 투여하는 것도 효과적일 것이다. 이에 대한 연구가 ASCOMALVA 연구(Journal of the Neurological Sciences, 2012)이다. 이 연구는 뇌혈관 질환을 동반한 AD 환자에서 choline alphoscerate와 donepezil 병용 요법이 효과적임을 보여주었다. 피험자들은 donepezil 10mg 단독 투여군 또는 donepezil 10mg/choline alphoscerate 600mg(1일 2회) 투여군으로 무작위 배정되었다.

Primary endpoint는 MMSE(mini mental state evaluation), GDS(global deterioration scale), ADAS-cog(Alzheimer’s disease assessment scale-cognitive subscale) 등을 평가하였고 secondary endpoint로 BADL(basic activities of daily living), IADL(instrumental activities of daily living), NPI(neuropsychiatric inventory) 등을 평가하였다. 피험자 210명이 연구에 참여하였고 양 군에 105명씩 무작위 배정되었으며, 2년 째 중간 연구 결과 도출 시기까지 연구에 참여한 환자는 양 군 50명 정도였다. 연구 결과, primary endpoint인 MMSE와 ADAS-cog 모두 donepezil/choline alphoscerate 병용군이 donepezil 단독군에 비해 유의하게 개선되었다. [그림 3]

▲ [그림 3] Donepezil/choline alphoscerate 병용 요법의 인지 기능 저하 감소 효과

또한 환자의 일상 생활 능력을 반영하는 BADL과 IADL도 donepezil/choline alphoscerate 병용군에서 유의하게 개선되었고, NPI-F 및 NPI-D도 의미 있게 호전되어 환자들의 행동 장애도 많이 감소했음을 알 수 있었다.

한편, 피험자들의 MMSE 점수에 따른 sub-analysis 결과도 발표되었다. MMSE가 24~21, 20~18, 17~14인 그룹으로 나누어 MMSE 변화를 평가하였는데, MMSE 24~21인 중증 치매 환자는 약물 투여 초기 MMSE가 개선되는 효과가 가장 두드러졌다. 따라서 중증 치매 환자일수록 약물 요법을 빨리 시작하는 것이 유리하다고 할 수 있겠다. 또한 양 군의 피험자들이 중증 치매(MMSE<10)로 진행되기까지의 시간도 비교하였는데, donepezil/choline alphoscerate 병용 요법은 중증 치매로 진행되는 시간을 donepezil 단독 요법에 비해 약 2배 가량 지연시키는 것으로 나타났다.

결론
ASCOMALVA 연구의 중간 분석 결과에 따르면 donepezil 단독 요법보다 donepezil/choline alphoscerate 병용 요법의 AD 개선 효과가 더 우수하고, 그 효과는 초기에 투여할수록 더욱 두드러졌다. 따라서 choline alphoscerate는 분명 AD 환자 치료에 도움이 될 수 있을 것이다. 이상반응이 거의 없기 때문에 많은 환자들에게 투여하기 적합하며, 앞으로 더 많은 임상 연구가 진행되어 이 약의 유효성을 입증할 수 있게 되길 기대한다.

< Q & A >
학술부: 한국인 치매 환자를 대상으로 한 분석이 현재 진행 중이다.

장우영: 치매 환자 치료에 분명 도움이 된다면, 연구의 한계를 보완하고 좀 더 정교하게 다듬어서 가치 있는 임상 근거 자료를 제시해 주셨으면 하는 바램에서 말씀 드렸다.

이문규: 작년에 보고되었던 내용과 어떤 차이가 있는가?

학술부: ASCOMALVA 연구는 애초에 1년 간 진행하고자 하였으나, 연구 과정에서 2년 및 4년까지 진행하는 것으로 수정되었다.

장우영: JNS에 발표된 연구의 중간 분석 결과가 우수하여 연구 기간이 연장된 것이다.

좌장(조광덕): Choline alphoscerate는 단순 AD 환자보다는 뇌졸중 등 뇌혈관 질환을 동반한 AD 환자에서 효과적이라고 들었다.

▲ 좌장 조광덕 교수(강릉아산병원)

정태익: AD의 질병 조절 약물(disease modifying drug)로 개발 성공한 약물이 없는데, 혹시 choline alphoscerate를 그런 약물과 병용 투여할 경우 유효성에 대한 연구도 없을 것이다. 최근 보고된 바에 따르면 AD 백신의 3상 임상 연구가 성공할 것이라고 하는데, choline alphoscerate 병용 요법에 대한 연구도 진행되었으면 좋겠다.

장우영: 그 연구가 성공하면 choline alphoscerate 병용 요법에 대해서도 연구를 진행하지 않을까 싶다.

좌장(조광덕): 신경과 영역에서 NGS를 어떻게 활용할 수 있을지, choline alphoscerate의 유효성을 입증한 ASCOMALVA 연구에 대해 심도 있게 논의할 수 있었다. 참석해 주신 분들께 감사 드리고 이상으로 마치겠다.

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